潮霉素B 说明书

货号：CH0715

规格：1g /20ml（50mg/ml）  

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产品简介：

潮霉素B(Hygromycin B) 是一种由吸水链霉菌产生的抗生素，能够抑制细菌、真菌和一些高等真核生物细胞内的蛋白质生物合成来。潮霉素B属于是氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质的合成来阻止微生物生长，对原核细胞与真核细胞都是抑制作用。

Hygromycin B 常用于转基因实验的抗性筛选，筛选具有潮霉素B的抗性基因。

 

操作步骤(仅供参考)：

根据实验具体要求操作。

 

1.常用筛选浓度

注意：潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型，培养基，生长条件和细胞代谢率而变化，推荐使用浓度为50-1000μg/mL。对于第一次使用的实验体系建议通过建立杀灭曲线（kill curve），即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。

一般而言，哺乳动物细胞50-500μg/mL；细菌/植物细胞20-200μg/mL；真菌300-1000μg/mL。

 

2. 杀灭曲线的建立

注意：为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度，可通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线）来实现，至少选择5个浓度。

1）  第一天：未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO2培养过夜；注：对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。

2）  根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定50，100，250，500，750，1000μg/mL。先用去离子水或者PBS buffer按照1:10的比例将母液稀释到5 mg/ml，然后按照下表稀释到相应浓度的工作液。

                                                                              

   终浓度（μg/mL）            培养基体积（mL）              5 mg/mL潮霉素B加入体积（mL） 

      50                9.9                                                                   0.1                                         

      100               9.8                                                                   0.2                                         

      250                                              9.5                                                                   0.5                                         

      500                                              9.0                                                                   1.0                                         

      750                                              8.5                                                                   1.5                                         

      1000                                            8.0                                                                  2.0                                          

3）  第二天：替换旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。

4）  接下来每3-4天更换新的含药物培养基。

5）  按照固定的周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。

 

3.   稳定转染细胞的筛选

1）  转染48h后，用含有适当浓度的潮霉素B筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。

注意：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密，其效率会降低。为了得到较好的筛选效果，最好将细胞稀释至丰度不超过25%。

2） 每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。

3）  筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。

4） 挑取并转移5-10个抗性克隆于35mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

5） 之后更换正常培养基培养即可。

 

注意事项

1） 避免与皮肤和眼睛接触，请小心操作。

2） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

 

安全信息

符号	GHS05, GHS06, GHS08
信号词	Danger
危害声明	H301 + H311-H318-H330-H334
警示性声明	P260-P280-P284-P301 + P310-P305 + P351 + P338-P310
个人防护装备	Eyeshields, Faceshields, full-face respirator (US), Gloves, multi-purpose combination respirator cartridge (US), type ABEK (EN14387) respirator filter
危害码 (欧洲)	T
风险声明 (欧洲)	23/24/25-36-42/43
安全声明 (欧洲)	23-26-36/37-45
RIDADR	UN 2810 6.1/PG 1
WGK德国	3